Analisi del processo di sintesi del farmaco chiave di Eli Lilly: Tirzepatide

Tirzepatide è un nuovo agonista a doppio recettore che prende di mira sia il GIP (peptide inibitorio gastrico) che il GLP-1 (peptide-1 simile al glucagone), sviluppato da Eli Lilly e commercializzato con successo per il trattamento mirato del diabete, della steatoepatite non alcolica (NASH) e del controllo cronico del peso, con un'emivita di 116,7 ore. Dopo la sua approvazione per il trattamento del diabete nel 2022, è stato ulteriormente approvato per la perdita di peso negli Stati Uniti nel novembre 2023. Uno studio clinico su larga scala ha riferito che i pazienti trattati con questo farmaco hanno raggiunto una riduzione di peso massima fino al 21%. La molecola è costituita da una struttura peptidica comprendente 39 aminoacidi e una catena laterale nel residuo Lys20. Di questi 39 amminoacidi, 37 sono presenti in natura (o codificati), mentre due non sono presenti in natura: i residui di acido ammino-isobutirrico non codificanti nelle posizioni 2 e 13.

Per ottenere una duplice attività, Tirzepatide non solo incorpora residui aminoacidici derivati ​​da GLP-1 e GIP, ma utilizza anche diversi residui aminoacidici unici. La sua struttura peptidica deriva principalmente da GLP-1, GIP, exenatide e semaglutide, con alcuni residui distintivi.

Nella ricerca sul processo di sintesi della Tirzepatide sono stati impiegati numerosi metodi per produrre peptidi sintetici. La selezione di un metodo di sintesi appropriato si basa tipicamente su caratteristiche molecolari, come la presenza di amminoacidi non codificanti, catene laterali non peptidiche e il numero di amminoacidi coinvolti.

Biosintesi：Le tecniche ricombinanti comunemente utilizzate per le macromolecole (come gli anticorpi monoclonali) possono essere applicate anche a peptidi più piccoli. In questo approccio, il DNA esterno viene introdotto nelle linee cellulari di Escherichia coli o di mammifero (ovaio di criceto cinese, CHO), dove i peptidi vengono sintetizzati dalle cellule. Sebbene la tempistica di sviluppo sia tipicamente più lunga di quella dei metodi di sintesi convenzionali, questo approccio è stato impiegato con successo per i peptidi semisintetici (ad esempio semaglutide, insulina degludec e liraglutide). Due inconvenienti di questo metodo sono: (1) difficoltà nell'introdurre amminoacidi non codificati da sequenze di DNA; e (2) la necessità di modifiche sintetiche post-ricombinanti per incorporare catene laterali non peptidiche.

CemicoSsintesi：

La sintesi peptidica in fase solida (SPPS) si è dimostrata efficace per molti peptidi di medie dimensioni (ad es.Lisinaptide eExenatide), compresi quelli sintetizzati utilizzando amminoacidi non codificanti. Sfortunatamente, per i peptidi più grandi (tipicamente> 30 aminoacidi), l'SPPS spesso soffre di basse rese del processo e scarsa purezza. Inoltre, a causa della necessità che numerose operazioni unitarie consecutive vengano eseguite senza errori (con un tasso di fallimento stimato del 20% per peptidi che superano i 30 aminoacidi), comporta rischi di produzione significativi.

Sintesi peptidica in fase liquida (LPPS). Questo metodo è simile all'SPPS, con l'eccezione che i peptidi in crescita non si legano alla resina e i loro C-terminali sono ammidi non reattive o esteri protetti. È adatto per sintetizzare peptidi più piccoli (≤10 aminoacidi), ma la resa e la purezza diminuiscono rapidamente con l'aumentare della lunghezza del peptide.

Il metodo ibrido SPPS/LPPS. Questo approccio utilizza SPPS per produrre frammenti peptidici corti di elevata purezza e intermedi di precipitazione ben caratterizzati, evitando così molti rischi di produzione e problemi di purezza inerenti ai costrutti SPPS più lunghi. Successivamente i frammenti protetti vengono accoppiati in fase liquida.

Il metodo ibrido SPPS/LPPS, che combina i vantaggi di entrambe le tecniche, rappresenta un eccellente approccio. Per implementare questa strategia ibrida, è necessario prima selezionare i frammenti appropriati sintetizzati tramite LPPS. Le considerazioni chiave nella selezione dei frammenti includono la lunghezza del peptide, il numero totale di frammenti, l'identità degli amminoacidi nei siti di clivaggio e le caratteristiche della catena laterale. La dimensione e la quantità dei frammenti sono fondamentali; sebbene i frammenti più piccoli possano raggiungere un'elevata purezza, necessitano di processi di produzione più complessi che comportano ulteriori fasi LPPS. Al contrario, un numero inferiore di frammenti di grandi dimensioni impone maggiori sfide di produzione e comporta rischi maggiori per il raggiungimento di un’elevata purezza. Dopo aver valutato questi fattori, i ricercatori della Eli Lilly hanno selezionato quattro frammenti per la sintesi della tilitropina. Per quanto riguarda i siti di clivaggio, una considerazione fondamentale è stata il diastereomerismo degli amminoacidi C-terminali in ciascun frammento, poiché lo scheletro ammidico facilita la diastereomerizzazione delα-stereocentro più facilmente rispetto agli amminoacidi protetti da Fmoc utilizzati nei costrutti SPPS. Dopo un'approfondita valutazione dei vari frammenti, alla fine sono stati scelti quattro frammenti specifici (Figure 2–5). Tutti e quattro i frammenti sono stati sintetizzati tramite SPPS, mostrano una facile separabilità come prodotti solidi e raggiungono livelli di purezza eccezionalmente elevati (97,5–99,5%).

Successivamente, frammento 2–5 sono accoppiati insieme attraverso un processo LPPS in quattro fasi.

Passaggio 1: collega i primi due frammenti, 2 e 3, che rappresentano gli amminoacidi 30–39 e 22–29, rispettivamente. Preparare soluzioni separate di frammenti 2 e 3 in dimetilsolfossido (DMSO) e acetonitrile (ACN), nonché PyOxim e diisopropiletilammina pura in ACN, e farli fluire insieme prima di entrare nel reattore con flusso a pistone (PFR) 27 per la miscelazione in linea per garantire l'uniformità；

Passaggio 2: gli aminoacidi ottenuti 22–39 (Composto 6) sono stati quindi accoppiati con il Frammento 4 per produrre gli amminoacidi 15–39 (Composto 7)；

Passaggio 3: la sequenza aminoacidica ottenuta 15–39 (Composto 7) è stato accoppiato con il Frammento 5 per produrre il tildropptide protetto da Boc；

Passaggio 4: rimuovere il rivestimento protettivo per ottenere Tirzepatide.

La nanofiltrazione è una tecnologia basata su membrana che separa le sostanze disciolte in soluzioni in base al peso molecolare e all'idrofobicità. La soluzione di reazione grezza passa attraverso la membrana, rimuovendo le impurità a basso peso molecolare come dibenzofurene (DBF), dietilammina (DEA) e sottoprodotti correlati a PyOxim (PyO), pur trattenendo i peptidi target. La selezione delle dimensioni appropriate dei pori è fondamentale, poiché richiede un equilibrio tra basso flusso (per pori eccessivamente piccoli) e perdita di peptidi (per pori eccessivamente grandi). Questa tecnologia consente una produzione su larga scala con procedure operative notevolmente semplificate.

Poiché la Tirzepatide è sintetizzata esclusivamente chimicamente, esistono numerosi produttori che producono il suo principio farmaceutico attivo (API), il che si traduce in un’intensa concorrenza. Attualmente, l'API di La tirzepatide è prodotta a livello nazionale da Hequan Pharmaceutical ed esportata all'estero per la preparazione della formulazione.

Riferimenti：Org. Ris. Processo Dev. 2021, 25, 1628−1636

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