5-amminofluoresceina

La 5-amminofluoresceina (chiamata anche 5‑AF o fluoresceinamina) è ampiamente utilizzata come reagente di marcatura fluorescente. L'ammina primaria della 5-amminofluoresceina può reagire con gruppi carbossilici (tramite attivazione EDC/NHS), aldeidi, chetoni o esteri attivati ​​(ad esempio esteri NHS) per formare legami ammidici o imminici stabili. Presenta un massimo di eccitazione a ~490 nm (λmax = 496 nm in tampone borato pH 8,5) e un massimo di emissione a ~515 nm, fornendo un segnale verde brillante con buona fotostabilità e uno spostamento di Stokes di circa 40 nm. La sua intensità di fluorescenza dipende dal pH e aumenta notevolmente in condizioni alcaline (pH 8‑9), il che è attribuito ai cambiamenti nello stato di protonazione del gruppo amminico.

La 5-aminofluoresceina ha trovato ampio utilizzo nella ricerca biologica e medica, dalla marcatura di proteine ​​e anticorpi alla costruzione di sistemi di somministrazione mirata di farmaci e sensori fluorescenti. La 5-amminofluoresceina è anche un intermedio chiave nella sintesi dell'isotiocianato di fluoresceina (FITC Isomero I), uno dei reagenti più popolari per la marcatura delle proteine.

Parametri del prodotto

Note sulla preparazione e conservazione

Il 5‑AF viene tipicamente sintetizzato a partire dall'acido 4‑nitroftalico, seguito da riduzione (ad esempio con idrazina/FeOOH) e condensazione con resorcinolo in acido metansolfonico. Il prodotto grezzo è una miscela di isomeri 5 e 6, che vengono separati mediante cristallizzazione. I metodi moderni (assistiti da microonde o enzimatici) possono migliorare la resa e ridurre i sottoprodotti. La purificazione finale mediante HPLC garantisce una purezza ≥95%, con struttura confermata da NMR e MS.

Conservazione: il composto è sensibile alla luce, all'aria e all'umidità. Conservare in un contenitore sigillato, spurgato con argon, a 4°C, al buio. Per la conservazione a lungo termine (>6 mesi), si consiglia di utilizzare la polvere a -20°C (stabile per almeno 3 anni). Le soluzioni in DMSO possono essere conservate a -80°C per 6 mesi o a -20°C per 1 mese. Evitare cicli ripetuti di congelamento-scongelamento. Il trasporto a temperatura ambiente è accettabile se protetto dalla luce e dall'umidità.

Domande frequenti (FAQ)

D1: Qual è la differenza tra 5‑aminofluoresceina (5‑AF) e FITC? Come scelgo?

R: Entrambi sono coloranti verdi fluorescenti, ma i loro gruppi reattivi differiscono.

● 5‑AF contiene un'ammina primaria (–NH₂). Richiede l’attivazione del gruppo carbossilico di un bersaglio (utilizzando EDC/NHS) prima della coniugazione. Ideale per etichettare molecole che contengono già un gruppo carbossilico.

● FITC ha un gruppo isotiocianato (–N=C=S) che reagisce direttamente con le ammine sul bersaglio (ad esempio, residui di lisina nelle proteine) – non è necessaria alcuna attivazione preventiva. FITC è più conveniente per l'etichettatura proteica di routine.

● Scegli 5‑AF se hai bisogno di una coniugazione specifica e orientata (ad esempio, tramite un handle carbossilico) o se prevedi di sintetizzare derivati ​​fluorescenti personalizzati. FITC è generalmente più semplice per l'etichettatura diretta degli anticorpi.

D2: Quali sono le condizioni tipiche di reazione per l'etichettatura delle biomolecole con 5‑AF?

R: Il metodo più comune è l'accoppiamento ammidico: attivare i gruppi carbossilici sulla molecola bersaglio con EDC e NHS (in tampone MES o PBS, pH 5,5–6,5), quindi aggiungere 5‑AF e regolare a pH 7,5–8,5. Incubare a temperatura ambiente o 37°C per 2–4 ore. Per target contenenti aldeidi (ad esempio, glicoproteine), utilizzare l'amminazione riduttiva con cianoboroidruro di sodio. Il colorante non reagito può essere rimosso mediante dissalazione o dialisi. Un buon punto di partenza è un rapporto molare colorante/proteina compreso tra 5:1 e 20:1.

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