Le cascate biocatalitiche consentono la produzione del peptide macrociclico Enlicitide

L’inibitore orale sperimentale del PCSK9 di MSD, l’enlicitide decanoato (MK-0616), è il primo inibitore orale del peptide macrociclico PCSK9 a dimostrare una sostanziale riduzione del colesterolo LDL nell’uomo. Enlicitide è stato sviluppato da uno schermo di visualizzazione di mRNA di peptidi monociclici e successivamente stabilizzato attraverso legami incrociati non peptidici per generare una struttura comprendente tre macrocicli fusi. Questo complesso octapeptide contiene sei amminoacidi innaturali e due proteinogenici collegati da 12 legami ammidici e un collegamento a catena centrale a sei atomi di carbonio. La sintesi chimica tradizionale richiede 43 passaggi, manipolazioni del gruppo protettivo (quasi la metà dei passaggi sintetici), purificazioni cromatografiche e una fase di metatesi di chiusura dell'anello catalizzata da rutenio altamente diluito, limitando la scalabilità e la sostenibilità.

Sviluppo della produzione chemoenzimatica

Gli scienziati di MSD hanno sviluppato un processo chemoenzimatico conciso e convergente per produrre il decanoato di enlicitide (1) reso possibile dall'accoppiamento diretto dei monomeri da parte delle ligasi degli amminoacidi, combinato con la legatura biocatalitica dei frammenti peptidici e le macrociclizzazioni utilizzando esterasi e immina reduttasi.

Risultati chiave

Assemblaggio a cascata di tre enzimi utilizzando ligasi che afferrano l'ATP

- Una cascata di tre enzimi (due ligasi ingegnerizzate per la cattura dell'ATP + riciclo dell'ATP) assembla un tetrapeptide da amminoacidi non protetti. Le ligasi che afferrano l'ATP (in particolare le ligasi degli amminoacidi dipendenti dall'ATP, AAL) sono enzimi che catalizzano la formazione di legami ammidici tra amminoacidi o peptidi non protetti utilizzando l'ATP come fonte di energia. Il loro meccanismo procede attraverso un intermedio di anidride mista, che consente l'accoppiamento diretto senza la necessità di gruppi protettivi sull'ammina nucleofila o donatori di acile attivati. In questo studio, i ricercatori hanno utilizzato una ligasi che cattura l’ATP dal Bifidobacterium adolescentis (BaAAL) e varianti ingegnerizzate (Trp-BaAALEng e Phe-BaAALEng) per estendere selettivamente un dipeptide con due amminoacidi non naturali (analoghi del triptofano e della fenilalanina) in una cascata one-pot. Queste ligasi hanno una tasca elettrofila stretta e sepolta che accetta singoli amminoacidi come elettrofili (substrati C-terminali) ma può ospitare peptidi più lunghi come N-nucleofili. Questa selettività li rende ideali per l'assemblaggio sequenziale di peptidi privi di gruppi protettivi dal C-terminale all'N-terminale. L'ATP consumato viene riciclato utilizzando una polifosfato chinasi (FbPPKWT) con esametafosfato poco costoso come donatore di fosfato.

Macrolattamizzazione regioselettiva dell'esterasi ingegnerizzata (RsEstEng).

- L'esterasi ingegnerizzata (RsEstEng) catalizza la macrolattamizzazione regioselettiva per formare il frammento settentrionale (resa del 73%, scala da 52 kg). RsEstEng è derivato da una carbossilesterasi di tipo selvaggio (RsEst) identificata da Roseibacillus sp. La sua funzione nativa è l'idrolisi dei legami esterei. Attraverso un’evoluzione diretta, i ricercatori lo hanno convertito in un catalizzatore per la macrolattamizzazione regioselettiva – la formazione di un legame ammidico macrociclico – nella sintesi del frammento settentrionale (4) dell’enlicitide. Accetta l'estere tert-butile stabile e voluminoso del tetrapeptide lineare (9) come donatore di acile per produrre il peptide macrociclico (4) per formare un legame ammidico intramolecolare. Ha ottenuto una ciclizzazione selettiva senza oligomeri rilevabili e solo lo 0,8% di sottoprodotto dell'idrolisi dell'estere, anche nelle condizioni di elevata forza ionica della precedente cascata enzimatica.

Legatura intermolecolare della tioesterasi ingegnerizzata (BlTEEng).

- La tioesterasi ingegnerizzata (BlTEEng) esegue la legatura intermolecolare dei frammenti settentrionali (4) e orientali (3) senza epimerizzazione. BlTEEng è una versione modificata di un dominio tioesterasi (TE) originariamente eliminato dal peptide sintetasi non ribosomiale (NRPS) del Brevibacillus laterosporus (BlTE). Le tioesterasi di tipo selvaggio nei sistemi NRPS catalizzano tipicamente la macrociclizzazione o il rilascio di peptidi lineari da una proteina trasportatrice tramite un legame tioestere. Le varianti ingegnerizzate di BlTE hanno mostrato una certa attività ma hanno favorito un sottoprodotto dimerico. L'ingegneria enzimatica ha spostato l'enzima per catalizzare la legatura intermolecolare utilizzando esteri isopropilici più stabili invece dei tioesteri naturali, idroliticamente labili.

Macrociclizzazione dell'amminazione riduttiva a cascata di quattro enzimi

- La cascata di quattro enzimi (PsIREDEng, KsKREDEng e gli enzimi di riciclo dei cofattori StLDHWT, TvADHWT) raggiunge la macrociclizzazione dell'amminazione riduttiva per formare una diammina biciclica (resa del 69%, scala da 46 kg). KsKREDEng è una chetoreduttasi ingegnerizzata da Kyrpidia sp. Catalizza l'ossidazione di un composto alcolico benzilico (10) in un'aldeide transitoria (11) dipendente dal NAD+. PsIRED è un'immina reduttasi di Pseudogymnoascus sp. È NADPH-dipendente. PsIREDEng catalizza l'amminazione riduttiva dell'aldeide (11) e dell'ammina esistente per formare l'immina ciclica (12), seguita dalla riduzione al macrociclo dell'ammina secondaria (13). StLDHWT rigenera il NAD+ per la fase ossidativa riducendo il piruvato in lattato, mentre TvADHWT rigenera il NADPH per la fase riduttiva ossidando l'isopropanolo in acetone.

Macrociclizzazione finale tramite tioesterasi PBP ingegnerizzata

- L'accoppiamento chimico con il frammento Western (2), seguito dalla tioesterasi proteica legante la penicillina (SsPBP-TEEng), chiude il macrociclo finale ad alta concentrazione (70 g/L) - superando la tipica limitazione di diluizione (5 g/L nella sintesi tradizionale). Il processo complessivo comprende tre fasi a cascata, 7 enzimi ingegnerizzati + 3 ausiliari, resa complessiva del 39%, dimostrazione su scala multichilogrammo, purezza >99%, nessuna cromatografia e nessun gruppo protettivo. Questo lavoro fornisce un modello sostenibile e scalabile per la produzione di peptidi macrociclici complessi, riducendo drasticamente il conteggio dei passi e gli sprechi, migliorando al contempo l’efficienza e l’accesso dei pazienti.