2'-O-metil-rA(N-Bz)fosforamide

La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) è un monomero fosforamiditico modificato che può essere utilizzato per la sintesi di oligonucleotidi. La modificazione 2′-O-metile conferisce una notevole resistenza alle nucleasi agli oligonucleotidi preservando le proprietà di legame idrogeno dei duplex RNA/RNA più fedelmente rispetto agli ibridi DNA/RNA. Nelle applicazioni di interferenza dell'RNA (RNAi), la fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) viene spesso incorporata nei filamenti senso e antisenso di piccoli duplex di RNA interferenti (siRNA) per migliorare la stabilità del siero e ridurre gli effetti fuori bersaglio senza compromettere l'attività dell'RNAi. La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) funge anche da elemento fondamentale nella sintesi chimica degli oligonucleotidi di RNA contenenti modifiche 2′-O-metiladenosina site-specific; i gruppi protettivi (DMT a 5′, Bz a N6, CE fosforamide a 3′) consentono l'assemblaggio graduale di filamenti di RNA con alta fedeltà e controllo su sintetizzatori automatizzati di DNA/RNA. Oltre alle terapie dell'RNA, la fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) ha trovato applicazione nella sintesi di modelli di RNA ramificati con fosfato per lo studio di architetture insolite di RNA e nella preparazione di sonde oligonucleotidiche fluorescenti stabilizzate termicamente.

Parametri del prodotto

Perchè Cosperpharm? – I nostri vantaggi competitivi

Vantaggi del prodotto

1. Modifica 2′-O-metil per resistenza alla nucleasi e stabilità termica

La modificazione 2′-O-metile nella posizione 2′ del ribosio è una delle modifiche chimiche più ampiamente convalidate nelle terapie oligonucleotidiche. Gli oligonucleotidi che incorporano la fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) mostrano una resistenza marcatamente migliorata alle endo- ed esonucleasi rispetto all'RNA non modificato, con una migliore stabilità termica dei duplex RNA/RNA (aumento della Tm) senza compromettere la specificità dell'accoppiamento delle basi Watson-Crick. Questa modifica è stata utilizzata con successo in farmaci oligonucleotidici approvati dalla FDA e in numerosi candidati in fase clinica.

2. Protezione N6-benzoile per sintesi ad alta fedeltà

Il gruppo protettivo benzoile (Bz) sull'ammina esociclica N6 della base adenina previene reazioni collaterali indesiderate durante il ciclo di accoppiamento della fosforamidite, come eventi di ramificazione o terminazione della catena causati da depurinazione o acilazione. Il gruppo Bz viene rimosso in modo pulito in condizioni standard di deprotezione oligonucleotidica (ammoniaca concentrata, 55°C, 8–16 ore o AMA), producendo la base adenina nativa senza sottoprodotti rilevabili.

3. Pre-organizzazione della conformazione dello zucchero C3′-Endo

La sostituzione 2′-O-metil blocca lo zucchero ribosio in una conformazione C3′-endo (Nord), la stessa conformazione adottata dall'RNA nei duplex in forma A. Questa pre-organizzazione conformazionale riduce la penalità entropica in seguito all'ibridazione con bersagli di RNA complementari, risultando in una maggiore affinità di legame (Tm più elevata) per gli oligonucleotidi 2′-O-metil-modificati rispetto al DNA o all'RNA non modificato della stessa sequenza.

4. Compatibilità del gruppo di protezione standard per la sintesi automatizzata

La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) trasporta gli stessi gruppi protettivi 5′-O-DMT e N6-Bz utilizzati nelle fosforamiditi di RNA standard, insieme a una fosforamidite β-cianoetil (CE) nella posizione 3′. Questo design garantisce un'integrazione perfetta nei flussi di lavoro dei sintetizzatori automatizzati di DNA/RNA esistenti senza richiedere protocolli di deprotezione specializzati o condizioni di accoppiamento modificate.

5. Ampia utilità terapeutica attraverso le piattaforme oligonucleotidiche

La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) viene utilizzata in più piattaforme terapeutiche oligonucleotidiche: siRNA (modificazioni del filamento senso e antisenso), oligonucleotidi antisenso (ASO) per il silenziamento genico, aptameri per la somministrazione mirata e applicazioni diagnostiche e sonde di RNA modificate per la diagnostica molecolare. La modificazione 2′-O-metile è inoltre ampiamente utilizzata negli RNA guida CRISPR‑Cas per migliorare la stabilità e l'efficienza di editing.

Scenari applicativi

1. Sviluppo terapeutico siRNA

La fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) viene utilizzata per introdurre modifiche della 2′-O-metiladenosina nei filamenti senso e/o antisenso di piccoli duplex di RNA interferenti (siRNA) per migliorare la stabilità del siero, ridurre gli effetti fuori bersaglio mediati dal meccanismo RNAi (ad esempio, caricamento del filamento passeggero) e diminuire l'immunostimolazione (attivazione TLR7/8). La modifica 2′-O-metile è un componente standard di molte piattaforme siRNA clinicamente avanzate.

2. Produzione di oligonucleotidi antisenso (ASO).

La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) è ampiamente incorporata negli oligonucleotidi antisenso per applicazioni di silenziamento genico. La modificazione 2′-O-metile conferisce resistenza alle nucleasi agli ASO nei fluidi biologici e migliora l'affinità di legame con target di RNA complementari senza interrompere i meccanismi di scissione mediati da RNasi H (se posizionati in disegni gapmer 2′-O-metil/2′-deossi).

3. Sintesi chimica dell'oligonucleotide dell'RNA

La fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) funge da elemento costitutivo per la sintesi chimica in fase solida di oligonucleotidi di RNA contenenti residui di 2′-O-metiladenosina sito-specifici. I gruppi protettivi (5′-O‑DMT, N6‑Bz, fosforamide CE) sono compatibili con i cicli di sintesi dell'RNA standard e le condizioni di deprotezione (NH₃, 55°C, 8–16 h o AMA), consentendo un'integrazione perfetta nei flussi di lavoro di sintesi consolidati.

4. Design della sonda oligonucleotidica fluorescente

Le modifiche 2′-O-metile migliorano la stabilità termica delle sonde fluorescenti (ad esempio, fari molecolari, sonde TaqMan) utilizzate nella PCR in tempo reale e nell'ibridazione in situ. La fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) consente l'introduzione di modifiche stabilizzanti nelle sequenze della sonda, aumentando il rapporto segnale/rumore e consentendo un rilevamento più affidabile di target di RNA a bassa abbondanza.

5. Sviluppo di aptameri Incorporanti aptameri chimicamente modificati

I nucleotidi 2′-O-metil mostrano una migliore resistenza alla nucleasi, un'emivita in vivo estesa e una maggiore affinità di legame con il bersaglio rispetto agli aptameri di RNA non modificati. La fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) è un elemento fondamentale per la generazione di librerie di aptameri modificati con 2′-O-metil tramite sintesi in fase solida.

6. Modifica CRISPR‑Cas Guide RNA (gRNA).

Le modifiche 2′-O-metil posizionate in posizioni specifiche nei gRNA CRISPR‑Cas possono migliorare la stabilità, ridurre l'immunogenicità e migliorare l'efficienza di modifica nelle cellule e in vivo. La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) consente l'introduzione specifica del sito di residui di 2′-O-metiladenosina nei gRNA sintetizzati chimicamente.

7. Ricerca sull'RNA ramificato fosfato

I ricercatori che studiano architetture di RNA insolite, come l'RNA ramificato con fosfato, utilizzano la fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) per preparare oligonucleotidi modello contenenti un singolo gruppo 2′-OH libero per studiare la stabilità idrolitica dei collegamenti ramificati fosfotriestere in condizioni fisiologiche.

8. Studi di stabilità termica di oligonucleotidi modificati

La fosforamidite 2′-O-metil-rA (N-Bz) viene utilizzata in studi sistematici sulla stabilità termica (Tm) di duplex oligonucleotidici modificati, inclusa la caratterizzazione degli effetti posizionali delle modifiche 2′-O-metile sulla temperatura di fusione del duplex e sulla termodinamica dell'ibridazione.

9. Sintesi di oligonucleotidi in fase solida

Sviluppo del processo I chimici di processo e gli specialisti della sintesi di oligonucleotidi utilizzano la fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) per ottimizzare le condizioni di accoppiamento, i protocolli di deprotezione e i metodi di purificazione per la produzione su larga scala di sostanze terapeutiche a base di acido nucleico 2′-O-metil-modificato. Cosperpharm fornisce dati analitici specifici per lotto per supportare la convalida del processo e le attività di scale-up.

10. Sviluppo di metodi analitici per il controllo di qualità degli oligonucleotidi

La fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) viene utilizzata come standard di riferimento nello sviluppo di metodi HPLC e LC‑MS per quantificare il contenuto di nucleosidi modificati nelle sostanze farmaceutiche oligonucleotidiche e nei prodotti farmaceutici, nonché per identificare le impurità correlate alla sintesi (ad esempio, rimozione incompleta del DMT, prodotti di depurazione, sottoprodotti dell'ossidazione dei fosfiti).

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Hai bisogno di fosforamidite 2′-O-metil-rA(N-Bz) affidabile e di elevata purezza per il tuo prossimo progetto di sintesi di oligonucleotidi? Il team di Cosperpharm è pronto ad assistervi con le specifiche del prodotto, le esigenze di documentazione e le soluzioni di catena di fornitura su misura per la vostra applicazione.